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細胞凍存和復蘇方法

發布日期:2017-01-07

為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣,考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異,有時因寄贈、交換和購買,培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室,最佳的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時,細胞內的酶活性均己停止,即代謝處于完全停止狀態,故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵,在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內,水晶呈針狀,極易招致細胞的嚴重損傷。
 
1.  細胞的凍存
為避免污染造成的損失,最小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化,需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前,細胞應該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基,成分可能如下:
◆包含10%甘油的完全培養基,
◆包含10%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養基,
◆50%細胞條件培養基和50%含有10%甘油的新鮮培養基,
◆50%細胞條件培養基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養基。
對于無血清培養基,一些普通的培養基成分可能是:
◆50%細胞條件無血清培養基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基,或
◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。
 
(1)懸浮細胞
●計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200~400 g離心5分鐘沉淀細胞,使用移液管移去上清到最小體積,不要攪亂細胞。
●以1×107到5×107細胞/ml密度,在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞,或者以0.5×107到1×107在無血清培養基中,再次懸浮細胞。
●分裝進凍存管,將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內開始冷凍步驟。
●細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉移到液氮中貯存。
 
(2)貼壁細胞
●使用分離試劑從基層分離細胞,分離時盡可能溫和,使對細胞的損傷減少到最小。
●在完全生長培養基中,再次懸浮分離細胞,確定有活力細胞數。
●以大約200 g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積,不要攪亂細胞。
●以5×106到1×106細胞/ml密度,在凍存液中懸浮細胞。
●分裝進凍存管,將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內開始冷凍步驟。
●細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉移到液氮中貯存。
 
2.  凍存細胞的復蘇
凍存細胞較脆弱,要輕柔操作。凍存細胞要快速融化,并直接加入完全生長培養基中。若細胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感,離心去除凍存培養基,然后加入完全生長培養基中。
 
(1)直接鋪板方法
●取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
●直接用完全生長培養基鋪板細胞。1 ml凍存細胞使用10~20 ml完全生長培養基。進行活細胞計數,細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。
●培養細胞12到24小時,更換新鮮的完全生長培養基,去除凍存劑。
 
(2)離心方法
●取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
●把1到2 ml凍存細胞加入到大約25 ml完全生長培養基,輕輕混勻。
●以大約80x g離心2到3分鐘。
●棄去上清。
●在完全生長培養基輕輕再次懸浮細胞,并且進行活細胞計數。
●細胞鋪板,細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。
 
3.  細胞的分化、衰老與死亡
(1)細胞的分化:一個成年人全身細胞總數約1012個,可以區分為200多種不同類型的細胞:形態結構,代謝,行為,功能等各不相同。追根溯源,這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以,通常把發育過程中,細胞后代在形態、結構和功能上發生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發生在胚胎階段,也發生在胎兒出生以后,乃至成人階段。例如,人體血細胞的產生和分化,這個過程在人的一生中一直持續著。
由旺盛生長不斷分裂的細胞,轉入分化,通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞,它們的基因表達和代謝活動各不相同。
(2)細胞的衰老:體外細胞培養實驗證明:
成纖維細胞:來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關);來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。
細胞衰老過程中會發生一系列的變化,包括:蛋白質合成速度降低,已有蛋白質結構變化,特異蛋白質成份出現;同時,細胞核,線粒體,膜系統、骨架系統等都有結構、功能的改變。
細胞衰老原因,尚無定論,出現過好幾種理論與假說,其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。
(3)細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正常現象,常見的細胞死亡形式有3種:壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中,因為環境因素的突然變化或病原物的入侵,導致一部分細胞死去,稱為細胞的病理死亡,或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學刺激時導致的細胞死亡;細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件,不依賴于其它兩種細胞死亡機理,如殺傷T細胞的細胞毒性作用。
 
還有一種情況,一部分細胞的死亡是生物個體正常生命活動(代謝、生長、發育、分化)的一個必要部分;似乎帶有“犧牲局部,保全整體”的意味。這種情況下的細胞死亡,明顯地受遺傳控制,稱為細胞凋亡。 凋亡(Apoptosis)則是程序性的、正常的細胞死亡,是機體清除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程,無論從形態學、生物學還是生化的特征來說,都有明顯的區別。細胞凋亡現象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起著互補與平衡的作用,在多細胞動物的發育、形態建成與維持中扮演至關重要的角色。作為細胞的一種基本生命現象,凋亡失控的結果將是可怕的:凋亡不足時,易發生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾病;而凋亡過量則可能產生獲得性免疫缺陷綜合征(HIV)、重癥肝炎與退行性神經疾病,如老年性癡呆癥(Alzheimer's disease)、帕金森氏癥(Parkinson's disease)。因此研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。
 
4.  細胞凋亡與壞死的區別
(1)壞死
形態學特征:膜完整性喪失,胞漿和線粒體膨脹,全細胞裂解。
生化特征:離子內環境失調,非能量依賴性的(被動過程,在4℃也可以發生),隨機消化DNA(電泳顯示為DNA彌散狀態),Postlytic 。
(2)DNA斷裂
生理學特征:影響群組細胞,由非生理學因素引起(如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等),被巨噬細胞吞噬,周圍有明顯的炎癥反應。
(3)凋亡
形態學特征:胞膜出芽,但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮、細胞核凝集,最后細胞分裂為凋亡小體,Bcl-2家族蛋白導致線粒體膜通透性增加。
生化特征:ATP依賴性的(主動過程,在4℃不能發生),以核小體為單位剪切DNA(電泳顯示為DNA ladder),Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中(細胞色素c、AIF),Caspases級聯活化,膜對稱性改變(PS外翻)。
生理學特征:只影響單個細胞,由生理學刺激誘導(如生長因子缺乏、激素環境改變等),被臨近細胞和巨噬細胞吞噬,無炎癥反應。

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